摘要：本研究在我国主要冬瓜产区采集具有典型病毒病症状的病叶材料105份，根据葫芦科作物上常见的5种病毒病原的CP基因设计特异性引物，对105份待检冬瓜材料进行RT-PCR检测。检测结果表明：5对特异引物可分别在105份待检材料的95份中检测到小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）4种病毒，未检测到南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus，SqMV）；并且发现不同的冬瓜主产区致病的病毒种类有较大差异；同时还发现，在这些待检样品中4种病毒复合侵染现象较普遍，其中以PRSV与WMV组合最常见，占复合侵染现象的31.25%；未发现有4种病毒复合侵染。
关键词：冬瓜； 病毒病； 病原鉴定
中图分类号： S 432.41
文献标识码： A
冬瓜[Benincasa hispida （Thunb.） Cogn.]属葫芦科冬瓜属，是一年生攀缘性草本植物，起源于中国和印度，广泛分布于亚洲的热带、亚热带及温带地区，目前以中国、东南亚和印度等地种植为主。冬瓜是一种经济价值高的农作物，在我国冬瓜栽培已有2 000多年的历史，年播种面积达25万hm2。由于市场需求的增加，冬瓜的栽种面积逐年扩大，复种指数提高，导致冬瓜上的病害日益严重。过去人们的关注焦点主要集中在疫病、枯萎病等真菌病害，在这些方面做了大量的研究工作。近年来，冬瓜病毒病呈上升趋势，所造成的危害已超过真菌病害，2003年以来，华南地区的冬瓜主产区冬瓜病毒病暴发成灾，造成冬瓜大幅减产，严重的甚至绝产绝收[1]。
引发冬瓜病毒病的病毒种类各国相继有报道。Samretwanich等[2]认为番茄卷叶病毒（Tomato leaf curl virus）是冬瓜病毒病的主要病原物，Chen等[34]报道台湾冬瓜病毒病的病原物是番茄斑萎病毒属（Tospovirus）成员，可能是西瓜银色斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus， WSMV）的1个菌株。Tsuda等[5]分析了从5个不同寄主上分离的Tospovirus属毒株，发现冬瓜分离物的蛋白质分子量是32 kD，S RNAs的分子量是1.21×106，与WSMV的序列同源率达97%。Okuda等[6]也证实在日本导致冬瓜产生病毒病的是WSMV。Tomassoli等[7]首次报道香石竹斑驳病毒属（Carmovirus）成员甜瓜坏死病毒（Melon necrotic spot virus，MNSV）是意大利冬瓜病毒病的病原物。这说明不同地区或国家引起冬瓜病毒病的病毒种类可能不一样。
目前，我国发现的侵染葫芦科作物的病毒中，分布最广、危害最重的有5种，即小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV
1 材料与方法
1.1 供试材料
待检材料：具有典型或可疑病毒病症状的冬瓜材料105份，分别采自我国冬瓜主产区，主要包括广东三水（7份）、台山（5份）、徐闻（8份）、清远（英德8份，清新3份）、广州（白云7份，番禺4份）；江西樟树（7份）；湖南（长沙4份，浏阳6份）；陕西（西安2份，宝鸡4份）；重庆（4份）；广西（南宁11份，桂林5份）；江苏大丰（9份）以及海南（文昌5份，儋州6份），保存于-80℃超低温冰箱。
阳性对照：ZYMV、WMV、SqMV毒源由中国农业科学院郑州果树研究所古勤生研究员惠赠，CMV和PRSV由华南农业大学植物病毒研究室提供。所有阳性对照均采用摩擦接种的方法接种到西葫芦（Cucurbita pepo L.）叶片上，待显症后采用DAS-ELISA法进行检测，确认病原为唯一病毒病原后，取叶片干燥保存。
1.2 方法
1.2.1 冬瓜叶片总RNA的提取
使用天根公司RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）提取待测样品和阳性对照的叶片总RNA，具体提取步骤参照产品说明书。
（1）匀浆处理：取50～100 mg冬瓜叶片，在液氮中迅速研磨成粉末状，加入450 μL 裂解液RL（使用前加入β巯基乙醇，终浓度为2%），混匀后室温放置5 min。
（2）13 400 g 离心5 min，取上清（约400 μL）于另一新离心管。
（3）缓慢加入上清0.5倍体积的无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀），将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，13 400 g 离心60 s，弃掉收集管中的废液，并将吸附柱CR3放回收集管中。
（4）向吸附柱CR3中加入700 μL去蛋白液RW1，13 400 g离心60 s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
（5）向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW（使用前已按比例加入无水乙醇），室温静置2 min，13 400 g离心60 s，弃掉收集管中的废液，并将吸附柱CR3放回收集管中。