摘要：【目的】鉴定灰树花交配型，为灰树花杂交育种提供理论依据。【方法】灰树花孢子萌发后挑取单孢进行镜检，收集孢子单核体；采用原生质体单核化获得原生质体单核体并通过互配确定标准测交菌株T1和T2；采用标准测交菌株与孢子单核体配对及孢子单核体互配后，进行孢子单核体交配型分类，并利用核迁移试验和OWE-SOJ技术鉴定孢子单核体交配型。【结果】分离鉴定获得71株灰树花孢子单核体菌株，原生质体单核化获得17株原生质体单核体菌株，其中标准测交菌株T1（A1B1）10株、T2（A2B2）7株；鉴定71株孢子单核体分别为T1、T2、T3和T4型，其中T1型28株、T2型35株、T3型 4株、T4型4株；核迁移试验鉴定T1、T2、T3和T4的交配型分别为A1B1、A2B2、A2B1和A1B2，OWE-SOJ鉴定结果分别为A1B1、A2B2、A1B2和A2B1。【结论】灰树花属于四极性交配型系统，其交配型分析应以核迁移试验为准，OWE-SOJ技术不适用于灰树花的交配型分析。
关键词： 灰树花；单核体；OWE-SOJ技术；核迁移试验；交配型
中图分类号： S646.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-0412-07
0 引言
【研究意义】灰树花（Grifola frondosa）又名贝叶多孔菌、莲花菇、舞茸（日本）等，分类学上隶属于真菌门、担子菌纲、无褶菌目、多孔菌科、树花菌属，是食、药兼用蕈菌（徐锦堂，1997）。灰树花食味鲜美，富含多种维生素、矿物质及生物活性物质，其多糖具有抗肿瘤、改善免疫系统、抗HIV病毒、调节血糖和血脂及胆固醇水平等作用（李小定等，2003），具有极高的利用价值，市场上对其需求量不断增加。有性生殖对食用菌子实体发育和种群多样性及其杂交育种非常重要，学者对食用菌交配系统及交配行为的研究从未间断，但对灰树花的交配型分析未见报道。因此，鉴定灰树花交配型及其交配型系统，对选育更优良高产的灰树花品种具有重要意义。【前人研究进展】近年来，有关灰树花的研究主要集中在活性成分方面（郭予斌等，2011；王帅
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 菌株 供试菌株库藏编号Gr0001+3源自东北食药用菌研究所的白灰树花，由福建省食用菌种质资源保藏管理中心提供。
1. 1. 2 培养基 PDA培养基（g/L）：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g。原种培养基（质量比）：木屑75.0%（粗∶细=1∶2），麦麸8.0%，玉米粉15.0%，蔗糖1.0%，石膏1.0%，配方水含量65.0%。栽培袋培养基（质量比）：木屑45.0%（粗∶细=1∶3），棉籽壳30.0%，麦麸8.0%，玉米粉15.0%，过磷酸钙1.0%，蔗糖1.0%，配方水含量65.0%。MYG再生培养基：麦芽糖5.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖10.0 g，维生素B1 30.0 mg，溶于1.0 L 0.6 mol/mL甘露醇。OWE培养基：5.0%橡树木屑浸汁200.0 mL，琼脂20.0 g，加蒸馏水定容至1.0 L。SOJ培养基：鲜榨橘汁200.0 mL，琼脂20.0 g，加蒸馏水定容至1.0 L。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 灰树花栽培 在23～25 ℃下菌丝走菌满袋后、原基开始形成时移入特定条件菇房出菇。菇房条件：温度16～18 ℃，湿度85%～95%，光照强度200～500 lx，二氧化碳浓度不高于1000 mg/L。形成猪脑状原基时，开袋出菇。
1. 2. 2 孢子单核体分离、鉴定 摘取已成熟的灰树花子实体，用75%酒精喷洒消毒，在超净工作台上用灭菌镊子撕取灰树花菇片置于已灭菌的硫酸纸上，菇片具菌管一面朝下。待弹孢24 h后，自封袋收集硫酸纸密封，4 ℃保存备用。
用移液枪吸取少量无菌水在硫酸纸孢子印处吸打，制成担孢子悬液，经梯度稀释至10-3，每个梯度吸取100 μL担孢子液涂布于抗性培养基上（100 μL氨苄西林/100 mL培养基），25 ℃暗培养。1周后待小菌落陆续出现即在显微镜下挑取新萌发菌丝或大菌落边缘的尖端菌丝，转接到PDA试管斜面培养基上。待菌丝长成一定大小的菌落后镜检，将无锁状联合的菌株保藏备用。
1. 2. 3 原生质体单核化和标准测交菌株确定 转接菌株Gr0001+3的菌丝于液体PDA培养基，25 ℃摇床培养7 d，以0.6 mol/mL甘露醇作渗透压稳定剂，采用2%真菌溶壁酶于pH 5.5和30 ℃下酶解5 h（薛平海等，2004）。获得原生质体后，于MYG再生培养基上涂布再生，25 ℃培养3 d，在显微镜下挑取刚萌发的原生质体并转移至PDA斜面继续培养。镜检观察并选取单核化菌丝（无锁状联合）保藏备用。