摘要：为探讨DNA条形码在中华鳖不同地理群体鉴定上的可行性，以中华鳖COⅠ基因全长序列为对象设计通用引物，对中华鳖6个地理群体及鳖科不同属间进行了遗传多样性分析。结果发现，不同地理群体中华鳖的遗传距离在0.020 3～0.041 7之间，群体内平均遗传距离在0.011 3～0.033 8之间，种间与种内的遗传距离没有形成有效的条形码间隙，在基于个体遗传距离的NJ树上，各群体间的个体并没有形成有效的分支。在对鳖科不同属进行分析时发现属间及属内遗传距离形成了明显的差异间隙，在NJ树上，不同鳖按照属的特性分别进行聚类，并具有较高的节点支持率，聚类分析可信度高。因此，COⅠ基因作为DNA条形码，能够有效地用于区分鳖科动物的不同属，但不适用于中华鳖地理群体的分离鉴定。
关键词：DNA条形码；COⅠ基因；中华鳖；地理群体；鳖科
中图分类号： S932.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）06-0030-06
中华鳖（Pelodiscus sinensis）隶属于动物界（Animalia）脊索动物门（Chordata）脊索动物亚门（Vertebrata）爬行纲（Repitlia）龟鳖目（Chelonia）曲颈龟亚目（Cryotodira）鳖总科（Trionychoidea）鳖科（Trionychidae）中华鳖属（Pelodiscus），又称甲鱼、水鱼、王八等，主要生活在淡水水域，为水陆两栖型动物。中华鳖地理分布非常广泛，在我国主要分布于长江及黄河流域等，国外主要分布于越南、日本和朝鲜等地[1]。一般认为，中华鳖无明显的亚种分化，但是存在很多地理变异，如黄河流域的黄河群体、浙江省宁波市姚江流域的姚江群体等。我国因地域辽阔，南北纬度差异大，各地域的生态条件不尽相同，所以，中华鳖在不同的地域所形成的基本形态也不尽相同，部分鳖经过人工的定向选育甚至还形成了新的品系，如清溪乌鳖。为保证中华鳖养殖业的稳定、健康和持续发展，进行良种选育以改善中华鳖苗种的质量极为重要，同时，通过有效的方法对不同地域中华鳖的种质进行鉴定和评价具有非常长远的意义。目前，DNA条形码作为一种成熟的mtDNA分子标记，已被广泛应用于物种的鉴定，在龟鳖类[2-6]、鱼类[7-9]、鸟类[10-11]、昆虫类[12]、及甲壳动物[13]等物种上均有相关报道，但在中华鳖不同地理群体的研究上，尚未见报道。
DNA条形码是Hebert等于2003年利用线粒体细胞色素C氧化酶I亚基（cytochrome C oxidase subunit I，CO I）构建物种鉴别体系时首次提出的，利用一段短的基因序列作标记对物种进行快速鉴定，并以此建立生物物种的个体与DNA序列一一对应的关系[14]。Hebert等比较分析了动物界9个门中13 320个同属不同物种的COⅠ基因序列，发现种内的差异基本上小于1%，种间的差异一般大于11.3%。因此，Hebert提出，应用COⅠ基因作为条形码进行物种鉴定时，种间遗传距离应为种内遗传距离的10倍及以上，种间遗传距离以2%为界[15]。
本研究通过对中华鳖6个地理群体的111个个体线粒体COⅠ基因序列进行比对分析，探讨COⅠ基因在中华鳖各群体间及群体内的序列变异，并构建系统进化树，进而检验COⅠ基因作DNA条形码在中华鳖群体鉴定上的有效性，以期为中华鳖地理群体的鉴定提供依据。同时，下载了鳖科不同属的其他鳖类的COⅠ基因序列，进行综合比对，探讨DNA条形码在鳖科属间鉴定的可行性。
1材料与方法
1.1试验材料
试验采集了不同地理群体的中华鳖（其中，姚江群体编号为Y1～Y34，日本群体编号为R1～R21，太湖群体编号为T1～T17，黄河群体编号为HH1～HH6，清溪乌鳖编号为 W1～W4和W6～W19，清溪花鳖编号为h1～h15），并结合从NCBI上下载的相关鳖科动物COⅠ基因序列一起进行分析（表1）。其中，印度鳖属的恒河鳖（Nilssonia gangeticus）、印度孔雀鳖（Nilssonia hurum）及黑鳖（Nilssonia nigricans）的拉丁名与蓝色动物学网（http：///reptile/gui/bie.htm）的命名有异，此处不做更正，均以下载序列的命名为准。
1.2总DNA的提取
中华鳖解剖前先置于0.05%的高锰酸钾溶液中浸泡 10 min 杀菌后，颈部放血处死，按常规解剖步骤，迅速取前腿肌肉，用液氮研磨成粉末。称取25～30 mg研磨后的粉末，装于1.5 mL灭菌离心管中，按样品信息编号，液氮速冻后于 -80 ℃ 保存。采用OMEGA公司的Tissue DNA Kit试剂盒提取中华鳖总DNA（详见说明书）。用1.5%的琼脂糖电泳检测DNA提取的质量，并用分光光度计检测其吸光度及浓度后，将符合要求的DNA溶液稀释成约30 ng/μL，待用。
1.3PCR扩增和测序
采用Primer Premier 6.0结合Oligo 7软件，以中华鳖线粒体COⅠ基因全长序列为对象，设计通用引物RC122-F（5′-CCAGTGACTTTAACCCGTTGAT-3′）和RC122-R（5′-GAGAAAGAAACATGAAGGTCATGTG-3′），均由华大基因合成。
PCR反应采用50 μL体系，包括25 μL康为PCR Mix，2 μL RC122-F（10 μmol/L），2 μL RC122-R（10 μmol/L），17 μL ddH2O，4 μL DNA模板。PCR反应程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，33个循环；72 ℃ 7 min。扩增完成后，将PCR产物全部吸入到1×TBE缓冲液配制的1.5%琼脂糖凝(转自：wWw.bdFqy.com 千 叶帆 文摘:基于COⅠ基因的DNA条形码在鳖科动物鉴定上的应用)胶点样孔，用100 V恒压电泳检测，确认为所需目的条带，进行割胶及目的条带回收，低温保存送至华大基因进行双向测序。测序所用引物与PCR引物相同。