摘要：从湖南省汨罗市血吸虫防治基地土壤中分离得到1株灭螺活性较强的微生物菌株B59，以B59菌株的总DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增并测其核酸序列，得到1条约1 500 bp的片段。通过Blast软件在GenBank中进行同源性检索，将其与同源性较高的菌株的ITS序列进行ClustalX序列差异和同源性分析，分别使用MEGA 6.0软件中的邻接法、Phylip软件中的最大简约法及最大似然法构建系统发育树。结果显示，3种方法构建的系统发育树基本一致，B59菌株与Bacillus cereus的亲缘关系最近，聚为一支，相似度达100%。
关键词：钉螺；微生物；16S rDNA；系统发育树
中图分类号： R383.2+4；S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0016-03
血吸虫病是一种严重危害人类公共健康和社会经济发展的人兽共患寄生虫病，主要流行于非洲、东南亚等国家，每年有690万～750万人被感染[1]，虽然目前在我国得到了很好的控制，但是日本血吸虫病仍然被政府认定为4种高度传染病之一[2-3]，甚至在许多地区，服用大剂量吡喹酮后的人群再感染率仍大于20%[4]。湖北钉螺是日本血吸虫唯一的中间宿主，是造成日本血吸虫病流行的重要根源。据统计，截至2013年底血吸虫病流行县（市、区）比2012年新增2个，达到454个，总人口为2.49亿人，血吸虫病的流行村有30 352个[5]。因此，控制钉螺以打破寄生虫的生活史是目前全国控制血吸虫病的比较重要和有效的措施[6]。但是由于复杂的经济、社会、环境和生物等因素的影响，目前仍不确定控制钉螺最经济有效的方法。目前控制钉螺的方法主要有3种，即物理灭螺、化学药物灭螺和生物生态灭螺。微生物灭螺由于其稳定、高效，对非靶生物无毒性，具有更多的生物多样性、丰富的代谢途径或产物，同时生长周期短，可诱导产物产生等优势[7-9]，是目前较有前景的灭螺方法，因此寻找理想的灭螺微生物的工作一直在进行。B59菌株是笔者实验室从土壤中筛选到的1株灭螺活性较高的微生物[10]，准确地对其进行分类鉴定是后续工作的必要前提。细菌16S rDNA序列分析技术具有高效、方便、准确、快捷等特点，广泛应用于各种细菌的遗传特征和分子差异的研究。本研究对B59菌株的16S rDNA PCR扩增产物的序列进行测定，对所测序列进行同源性分析和系统发育树构建，以鉴定其分类地位，为进一步应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 B59菌株是从湖南省汨罗市血吸虫病防治研究试验基地的螺池土壤中分离纯化得到，由笔者实验室保存。
1.1.2 主要试剂和仪器 2×Taq Master Mix、DNA marker（DL2000），均购自宝生物工程（大连）有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成；My CyclerTM thermal cycler PCR仪，购自美国Bio-Rad公司；UVP-GDS8000凝胶成像分析系统，购自美国UVP公司；PowerPac Univarsal电泳仪，购自美国Bio-Rad公司；H1850R台式高速低温离心机，购自湖南湘仪动力测试仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 菌体培养 供试菌株在LB斜面培养基上活化培养后接种于LB液体培养基中，28 ℃、160 r/min振荡培养过夜，4 ℃ 保存备用。
1.2.2 细菌基因组DNA的提取 参照DNA提取试剂盒的说明书提取B59菌株基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶
1.2.3 16S rDNA的PCR扩增 采用细菌16S rDNA的通用引物，F：5′-AGAGTTTGATCCGGCTCAG-3′，R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系（25 μL）为：2×PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物（50 μmol/L）各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳进行验证后，扩增产物送北京华大基因科技有限公司进行序列测定。
1.2.4 数据分析 运用ContigExpress软件进行序列拼接以得到B59菌株的16S rDNA基因全序列，将其提交至GenBank核酸序列数据库（ http：//www.ncbi. nlm.nih.gov），在NCBI上进行Blast在线检索，搜索其相近序列，采用ClustalX进行多序列比对后，通过MEGA 6.0中的邻接法（NJ）、Phylip 3695中的最大简约法（MP）及最大似然法（ML）[11]构建系统发育树，并进行Bootstrap稳定性检验（1 000次）。
2 结果与分析
2.1 16S rDNA的PCR扩增结果
以“1.2.2”节中的方法提取得到B59菌株的基因组DNA，电泳检测到其条带清晰，无拖尾现象，可直接用于PCR。菌株B59的16S rDNA扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到1条约1 500 bp的特征性条带（图1），与预期的大小一致，扩增特异性较高。
2.2 目的基因16S rDNA序列分析
运用ContigExpress软件对序列进行杂峰修正和正反序列拼接，结果表明B59菌株的16S rDNA长度为1 490 bp（图2）。
2.3 系统发育树构建
将B59菌株的16S rDNA序列在GenBank中进行在线Blast比对，以大肠埃希菌（Escherichia coli）为外群，选取同源性较近的9个序列与B59菌株建立比对模型，分别运用NJ、MP、ML法一起构建基于16S rDNA序列的系统发育树，利用Bootstrap生成1 000个自展数据集对进化树进行可靠性分析（图3、图4、图5）。