摘要：利用1株实验室保藏的、分离自大棚黄瓜根际土壤的芽孢杆菌KN1进行发酵培养，在温室条件下研究KN1菌株对黄瓜根结线虫病的防治效果及其对黄瓜的促生能力，并对该菌株进行分子生物学鉴定。结果表明：接种60 d在温室盆栽试验中，KN1菌剂蘸根处理线虫减退率和防治效果分别为48.2%和41.5%，与单独使用10%噻唑磷颗粒剂效果相当，能够显着减少根结的生成，KN1菌剂蘸根与10%噻唑磷颗粒剂配合使用效果较好，线虫减退率和防治效果分别达71.5%和57.27%；KN1蘸根处理黄瓜植株鲜质量、根系干质量分别比不接种菌剂对照增加30.33%和 70.89%；基于16S rDNA系统发育分析结果显示，菌株KN1属于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），与苏云金芽孢杆菌serovar konkukian序列的相似度达99.5%，结合该菌的培养特征、形态特征将其鉴定为苏云金芽孢杆菌。菌株KN1的鉴定及对黄瓜的温室盆栽防治效果为研究其生防机制及开发应用提供了依据。
关键词：黄瓜；根结线虫；防治效果；促生作用；苏云金芽孢杆菌；生防机制；开发应用
中图分类号： S432.4+5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0101-03
随着设施蔬菜产业的发展，作物的病虫害日趋严重如根腐病、线虫病等病虫害，其中黄瓜根结线虫病为较突出的线虫病害之一。黄瓜根结线虫病由植物线虫南方根结线虫（Meloidogyne incognita）侵染引起的，主要危害侧根和须根，染病株发病初始地上部分症状不明显，发病严重时植株明显矮化，结瓜少而小，地上部分出现萎蔫或逐渐枯黄，最后植株枯死。目前，生产上对根结线虫的防治主要是利用化学药剂和抗病品种。在长期的作物生产中曾采用一系列措施防治根结线虫，包括化学和生物类杀线剂，但效果并不理想，原因在于根结线虫种间致病性和抗药性差异很大[1-2]，虽然在大多数情况下化学类杀线剂是有效的，但因存在环境污染和影响人类健康等问题而受到限制，亟待开发一种可代替化学杀线剂的生物类杀线剂。目前，在许多生物防治措施中经常利用食线虫真菌防治植物线虫病害，但尚很少有商品化生防制剂，且部分菌株对人体健康存在影响。因此，对根结线虫病的有效防治很有必要找出一种有效的天然生物制剂来替代巨毒化学农药。利用从健康黄瓜土壤中筛分的芽孢杆菌发酵后进行回接试验，以黄瓜为供试作物，在温室盆栽中进行防治黄瓜根结线虫病的生测试验[3]，为开发安全、高效防治黄瓜根结线虫病的生物制剂及合理应用起到一定的指导作用。
1材料与方法
1.1供试菌株
菌株KN1保藏于养分资源高效开发与综合利用国家重点实验室菌种保藏室，筛分自山东省临沂市大棚健康黄瓜根际土壤。
1.2培养基
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.2，在10万Pa下灭菌30 min。种子培养基：胰蛋白胨8 g，酵母提取物5 g，葡萄糖10 g，NaCl 5.0 g，pH值7.0，分装于300 mL三角烧瓶内，每瓶50 mL，10万Pa下灭菌15 min[4]。菌株发酵培养基：玉米淀粉2 g，黄豆饼粉2.67 g，酵母粉0.55 g、K2HPO4 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，CaCO3 0.04 g，ZnSO4 0.02 g，蒸馏水100 mL，pH值7.2，装于500 mL三角烧瓶内，10万Pa灭菌30 min[4]。
1.3菌株KN1的活化
取冰箱保存的试管斜面，划线活化于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，置于37 ℃生化培养箱中倒置培养，连续传代2次即得到活化菌株。
1.4菌株KN1制剂的制备
挑取活化后的健壮KN1菌落接种于种子培养基中，于 37 ℃、180 r/min条件下摇床培养18 h，按照10%的接种量接种于发酵培养基中，每瓶发酵培养基接种10 mL，置于 200 r/min 条件下摇床培养32 h，即得KN1发酵液，离心发酵液得上清液和菌体沉淀，将菌体沉淀用灭菌水配成含有100亿CFU/mL的KN1菌剂。
1.5菌株KN1黄瓜盆栽试验
1.5.1试验时间、地点试验于2016年9—12月在金正大生态工程集团股份有限公司的智能玻璃温室内进行，试验期间平均温度28 ℃，湿度70%左右。
1.5.2试验材料供试黄瓜品种北京301，种子由山东省潍坊市蔬菜研究所提供；供试药剂为10%颗粒噻唑磷，由日本石原产业株式会社生产；供试底肥为N、P2O5、K2O含量均为15%的硝基复混肥；供试土壤为砂姜黑土，有机质含量129 g/kg。
1.5.3试验设计先进行苗床育苗，25 d后选取苗床长势一致的黄瓜幼苗进行移栽，每盆2株。从温室大棚中取病土充分混匀，每盆装病土5 kg，硝基复混肥作为底肥一次性施入土壤，施入(原文来自：wWW.bDFqy.com 千叶 帆文摘:1株生防芽孢杆菌对黄瓜根结线虫的防治、促生作用及其鉴定)量为0.33 g/盆。空白对照组（CK），不接菌的病土；处理1（T1），用KN1菌剂（100亿CFU/mL）蘸根，处理2（T2），为药剂处理，将1 g 10%噻唑磷颗粒剂与病土均匀装盆；处理3（T3），在处理2的基础上移栽时再用KN1菌剂蘸根，每组设4个重复，其间适时定量浇水，管理措施一致。
1.5.4KN1菌株对黄瓜根结线虫的防效测定盆栽60 d后，取出根系周围土，混匀，取100 g作为调查土样，用贝曼漏斗法分离土壤中的线虫，调查土壤中2龄线虫的数量，与空白对照相比计算线虫减退率。土壤中线虫数量的测定参考 Castillo 等方法[5]；根结指数的测定和分级标准参照Bird等的方法[6-7]，并调查病株及根系受侵染程度，计算病情指数和防治效果。病害严重度分级标准[8]：0级，根系上无根结；1级，轻度感染，仅有少量的小根结，根结率在3.0%及以下；2级，根结率为3.1%～25.0%；3级，根结较多，根结率为 25.1%～50.0%；4级，在根瘤上有再次根结，50.1%～750%根系有根结；5级，根结相互连接成根结团块，75.0%以上根系有根结。