六堡茶中金花菌的分离与鉴定

　　摘要：【目的】研究鉴定六堡茶中的金花菌，为推动六堡茶产业发展提供一定的理论基础。【方法】采用平板涂布法及三点接种法从梧州中茶茶厂2015年11月生产的六堡茶中分离纯(转自：wWw.bdFqy.com 千 叶帆 文摘:六堡茶中金花菌的分离与鉴定)化金花菌，以传统的形态学观察法观察菌落特征，利用光学显微镜观察菌丝、分生孢子等结构特征，再结合分子生物学方法对分离获得的菌株进行DNA序列分析，并通过ITS序列进行同源性搜索比对和系统发育进化树分析。【结果】分离获得一株金花菌，命名为LB-1。LB-1菌株的形态特征与散囊菌属很相似，主要表现为：菌落呈金黄色、有同心环、有放射性脊等，其ITS序列与阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）的同源性达99%，进一步确定LB-1菌株为阿姆斯特丹散囊菌。【结论】从六堡茶中分离获得的金花菌LB-1为散囊菌属中的阿姆斯特丹散囊菌。在六堡茶加工中，可为LB-1菌提供适宜的环境，促进其大量繁殖，以增强六堡茶的保健功效。
　　关键词： 六堡茶；金花菌；阿姆斯特丹散囊菌；分离；鉴定
　　中图分类号： S571.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0658-05
　　Abstract：【Objective】Jinhua fungus in Liupao tea was identified in order to provide theoretical basis for Liupao tea industry development. 【Method】Spread-plate method and three-point inoculation method were adopted to isolate and purify Jinhua fungus from Liupao tea produced by China Tea（Wuzhou） Factory in November， 2015. The colony characteristics were observed by traditional morphology observation method， and the structures like hypha and conidium were observed via optical microscope. Then DNA sequence analysis for strain isolated was conducted combining molecular biology method， and homology searching and comparison via ITS sequence and phylogenetic tree analysis were carried out. 【Result】One strain of Jinhua fungus was isolated and named LB-1. The morphological characteristics of LB-1were similar to those of Eurotium： golden colony， concentric rings， radioactive ridge， etc. The homology of its ITS sequence to Eurotium amstelodamiwas 99%. Therefore， LB-1 was identified as E. amstelodami. 【Conclusion】Jinhua fungus LB-1 is isolated from Liupao tea， and identified as E. amstelodami in Eurotium. During processing of Liupao tea， the producers can create suitable environment for LB-1 and promote the mass reproduction of LB-1， so as to enhance the health care effects of Liupao tea.
　　Key words： Liupao tea； Jinhua fungus； Eurotium amstelodami； isolation； identification
　　0 引言
　　【研究意义】六堡茶因原产于广西梧州市苍梧县六堡乡而得名，属于黑茶类，为后发酵茶。六堡茶特殊的加工工艺：杀青—初揉—堆闷—复揉—干燥—筛选—拼配—渥堆—初蒸焗堆—复蒸—凉置—陈化（DB45/T 479-2014），使其具有独特的品质特征：干茶色泽黑褐光润，汤色红浓似琥珀，滋味醇和甘爽，润滑可口，有槟榔味，叶底红褐色，耐冲泡，以“红、浓、陈、醇”四绝着称，耐于久藏，越陈越好（何志强，2007）。近年来，以普洱茶为代表的黑茶类在市场上掀起了热潮，黑茶中微生物鉴定也成为海内外学者研究的热点，出现了大量关于茯砖茶中金花菌的研究报道，如陈椽（1984）提出，金花菌能够分泌淀粉酶催化茶叶中的淀粉转化为单糖，还可分泌氧化酶催化多酚类化合物氧化，从而消除茶叶枝梗的粗老气味，使茶汤呈红棕色，滋味也更加醇厚并带有甜味；杨抚林（2005）在体外模拟胃液的试验中发现金花菌发酵液对胃蛋白酶活性有促进作用，但对脂肪酶活性有抑制作用；邓放明等（2007）研究发现黑茶中的金花菌具有降脂、减肥、促进消化、改善人体肠道的功效，其发酵产物胞外多糖还具有抑制肿瘤的功效。人们通常根据金花菌的质量和数量来判断茯砖茶品质的好坏，因此，研究六堡茶金花菌，对改善六堡茶的加工工艺、促进六堡茶产业发展具有重要意义。【前人研究进展】黑茶中的微生物种类繁多且对茶叶的影响较大。近年来，关于金花菌的鉴定研究较多并已取得较大进展。黄浩等（2010）从湖南益阳茶厂2008年生产的金湘益砖茶中分离纯化得到一株金花菌，在光学显微镜下观察菌株形态、在扫描电镜下观察菌株的子囊孢子（有性阶段）和分子孢子（无性阶段），同时结合DNA测序，在分子水平上对分离菌株进行鉴定，确定该菌株为冠突散囊菌。彭晓赟等（2011）对湖南地区茯砖茶上金花菌的菌落特征和形态特征进行了研究，并运用扫描电镜观察了其子囊孢子和分生孢子的发育过程，鉴定其为冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。宋伟（2011）从黑砖茶中分离纯化获得5种真菌，经过形态学观察及分子鉴定确定5种真菌分别为：塔宾曲霉、阿姆斯特丹散囊菌、斑点青霉、冠突散囊菌和泡盛曲霉，其中的阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）和冠突散囊菌属于金花菌。徐书泽（2014）利用高通量测序技术对梧州茶厂4个成品六堡茶中的真菌多样性和菌落结构进行分析，通过传统形态学鉴定结合真菌分子鉴定技术从中分离鉴定得到5个属18个种的微生物，其中的散囊菌属为阿姆斯特丹散囊菌。胡谢馨等（2016）从茯砖茶中分离出一株优势菌株LS1，经形态学观察及ITS-5.8S rDNA序列分析，鉴定为冠突散囊菌。【本研究切入点】前人对黑茶类金花菌的研究主要集中在普洱茶和茯砖茶上，对广西六堡茶金花菌的研究报道较少。【拟解决的关键问题】采用平板涂布法从梧州中茶茶厂2015年产的六堡茶中分离金花菌，采用三点接种法对分离获得的金花菌进行培养，探索适宜其生长的培养基，通过运用光学显微镜观察菌落形态、参照真菌鉴定手册及结合现代分子生物学进行DNA测序，从分子水平上对六堡茶金花菌进行鉴定，为揭示六堡茶的安全性、提高六堡茶的品质及促进六堡茶产业的发展提供一定的理论基础。