摘要[目的]研究猪瘟病毒（CSFV）E0基因在PK15细胞中的表达特性。[方法]通过PCR方法克隆了E0基因全长681 bp的片段，连接到真核表达载体pEGFPC1上，构建出重组质粒并进行双酶切鉴定。[结果]成功构建出重组质粒pEGFPE0。通过双酶切鉴定，PCR鉴定和测序确定了目的基因大小一致，插入位置完全正确后，利用Lipofecta mine 2000转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK15中，转染48 h后在荧光显微镜下观察，可以看到大多数细胞呈现出绿色荧光，说明转染成功。通过G418筛选后，在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光，这表明重组融合蛋白pEGFPE0在PK15细胞中得到了表达。[结论]获得的能够表达重组融合蛋白的细胞克隆，为进一步大量表达与纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。
关键词猪瘟病毒；E0蛋白；增强型绿色荧光蛋白；PK15细胞
中图分类号S852.65+1文献标识码A文章编号0517-6611（2016）10-160-03
[Result] A recombinant plasmid pEGFPE0 was sucessfully constructed，by restriction enzyme digestion，PCR identification and sequencing，the size of the target gene and insertion position was determined and was right，then recombinant plasmid were transformed into pig kidneyderived cells PK15 by the Lipofecta mine 2000 transfection kit，after transfection 48h，many cells showed green fluorescence under a fluorescence microscope，which indicated the transfection was successful.After screening by geneticin，there were still green fluorescent cells under the fluorescence microscope，which indicated that the recombinant fusion protein of pEGFPE0 was expressed in the cell PK15.[Conclusion] The obtain of expressing recombinant fusion protein of cell clones lay a foundation for further mass production of soluble glycoprotein E0，preparing its monoclonal antibody epitope screening and researching the biological function of protein E0.
Key wordsCSFV； E0 protein； Enhanced green fluorescent protein； PK15 cell
猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起猪的一种高度接触性、致死性传染病，临床上以高热、皮肤和黏膜出现大量出血点为主要特征[1]。世界动物卫生组织将其列为 A 类传染病，我国也将其列为一类传染病。猪瘟病毒是黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），为单股正链RNA病毒[2]，其基因组编码1个多聚蛋白，经宿主细胞和病毒蛋白酶裂解后产生4种结构蛋白（C（p14）、E0（gp44/48）、E1（gp33）和E2（gp55））和7种非结构蛋白（Npro、p7、NS23、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）[3]。CSFV 自然感染猪后，机体可产生针对结构蛋白E2、E0和非结构蛋白NS23的抗体[4]。
E0蛋白是CSFV的一个保护性抗原蛋白，可诱导产生中和抗体，其抗原性与 E2 相比是能诱导机体产生保护性免疫力的第二抗原蛋白。E0蛋白由病毒 ORF中 GLu168ALa494 组成[5]，有 9 个可能的糖基化位点，糖基化前后的分子质量分别为 25.7 ku 和 44～48 ku[6]。E0是唯一一个可以分泌到猪瘟病毒感染的细胞培养液上清中的糖蛋白[7]。Shen等[8]研究表明 E0可单独诱导免疫保护，诱导产生的中和抗体可以抵抗大剂量猪瘟病毒的攻击。利用在昆虫细胞表达的 E0和 E2进行的抑制试验表明，E0和 E2 是与不同的细胞表面受体作用，猪瘟病毒最初是通过E0的介导才能结合到细胞上的[9]。另外，在各毒株内编码 E0的氨基酸序列比编码 E2 的氨基酸序列要更加保守[10]。因此，E0是防治猪瘟的主要靶蛋白之一。笔者利用猪源性的PK15细胞作为表达猪瘟病毒E0糖蛋白的表达系统，将猪瘟病毒E0基因在PK15细胞中进行表达，并进行双酶切鉴定，旨在为E0病毒的基因工程疫苗的实际生产和应用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞与质粒。PK15细胞来自河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室；真核表达载体pEGFPC1购自北京天恩泽公司，含有目的基因E0片段的pET28aE0（BL21）菌种由郑州大学分子免疫学实验室保存。
1.1.2工具酶及试剂。质粒DNA纯化试剂盒，为TaKaRa公司产品；Lipofecta mine 2000试剂盒为invitrogen公司产品；胎牛血清和DMEM培养基，购自Gibco公司；使用的培养基为DMEM（含10%胎牛血清、链霉素、青霉素）完全培养基，加入NaHCO3调节pH至7.0 。限制性内切酶Xho1和Kpn1以及T4连接酶，均购自TaKaRa公司。