摘要：猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是猪的肠道传染病病原，主要引起仔猪呕吐、腹泻和脱水，对一周龄内的哺乳仔猪危害最为严重，死亡率可达50%～100%。利用Vero86细胞从湖北某猪场腹泻仔猪小肠病料中分离到一株病毒，经RT-PCR检测、序列比对后确定其为PEDV，命名为HB201503株。设计PEDV s1基因的全长扩增引物，获得该株病毒的s1基因全长序列并进行了进化分析，结果表明该毒株与近年来在GenBank 登陆的PEDV s1基因核苷酸序列相似性在91.4%～99.2%，与疫苗株CV777相似性较低，仅为91.8%。通过s1基因进化树分析表明HB201503以及近几年国内分离毒株主要集中在第 I 个亚群，且HB201503株与KM406183（2014，四川）和KM609206（2015，江苏）同源性较高。此外，s1蛋白氨基酸序列比对显示，HB201503与近几年分离毒株及疫苗株CV777均在 55-74、157-163位氨基酸出现了连续4个以上氨基酸的缺失或替换，而且HB201503株与CV777及近几年分离毒株相比，还在270-283位氨基酸上出现了1个氨基酸的缺失和10个氨基酸的替换。
关键词：猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）；分离鉴定；s1基因；进化分析
中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）06-1506-05
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.036
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性、接触性、高度传染性消化道疾病，主要症状为呕吐、水样腹泻和脱水[1]。各日龄的猪均易感染，其中以哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪发病率最高，尤其以哺乳仔猪受害最为严重[2]。20世纪90年代后期，中国开始大面积使用传染性胃肠炎和流行性腹泻二联苗进行免疫，取得了很好的效果。然而最近几年，猪场在广泛应用PED灭活疫苗和弱毒疫苗的同时，仔猪流行性腹泻不断发生，甚至呈局部暴发流行，这提示可能PEDV发生了变异[3]。对中国最近几年流行性腹泻病毒进化发育分析表明，近年来大规模暴发流行性腹泻的原因可能是流行性腹泻病毒的s基因发生了变异[4]。PEDV的S蛋白可分为S1（1aa-735aa）区和S2（736aa-1383aa）区，其中S1区包含多个病毒主要中和表位和受体结合域，与病毒抗原性和吸附入侵密切相关[5]。因此对PEDV的分离鉴定及s1基因的进化分析对PEDV的防控具有重要意义。本研究从湖北某暴发仔猪腹泻的猪场分离到一株PEDV并命名为HB201503，并对其s1基因进行了克隆测序。将测序结果与最近几年NCBI登陆的PEDV毒株及疫苗株CV777的s1基因核苷酸序列进行了进化分析，旨在为猪流行性腹泻的防控及免疫机理的研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌DH5α感受态细胞购至康为世纪科技生物有限公司；pET-30A（+）载体、PEDV检测引物参照文献[6]合成；Vero 86细胞由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医团队保存。
1.2 主要试剂
AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒购自康宁生命科学有限公司，One-step RT-PCR Super Mix购自北京全式金生物科技有限公司，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自康为世纪科技生物有限公司，同源重组酶购自南京唯赞生物科技有限公司，BamH I和Hind Ⅲ快切酶均购自TaKaRa公司，胰蛋白示磷酸盐肉汤（Tryptose Phosphate Broth）购自上海浩然生物技术有限公司，氨苄青霉素（Amp）、链霉素（Kan）、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶均购自Invitrogen公司。
1.3 试验方法
1.3.1 细胞培养 采用DMEM培养基（100 U/mL氨苄青霉素，100 μg/mL链霉素，5%FBS）对Vero 86细胞进行培养，培养条件为37 ℃，5%CO2。
1.3.2 病毒分离 采集湖北某猪场腹泻仔猪小肠及内容物加入5倍体积的生理盐水后进行组织匀浆并用0.22 μm微孔滤膜过滤后参照文献[7]中的PEDV分离方法进行病毒分离，具体为：将长满单层Vero 86细胞的6孔板利用PBS缓冲液（不含镁离子和钙离子）洗涤两遍后每孔加入500 μL处理好的病毒悬液，37 ℃、5%CO2条件下孵育30 min，每孔中加入2 mL的DMEM（100 U/mL氨苄青霉素，100 μg/mL链霉素，0.3%TPB）及10 μg/mL的胰酶2 mL。当80%以上细胞出现细胞病变时反复冻融收集病毒悬液。将病毒悬液继续按上述方法接种于Vero上，连续传代3次后对出现细胞病变的阳性孔进行
1.3.3 引物设计 根据GenBank 上近几年登陆的PEDV毒株的基因序列，利用DNAman比对序列后在s1基因序列两边的保守区域利用Primer 5.0设计了一对扩增s1基因序列全长的同源重组引物。引物序列为：上游引物F：5′-GCCATGGCTGATATCGGATCCTCTAATCATTTGGTCAACGTA-3′，下游引物 R：5′-CTCGAGTGCGGCAAGCTTCATTACAAACATA
TGTAACG-3"；检测引物序列为：上游P1：5′-TTCGGTTCTATTCCCGTTGATG-3′，下游P2：5′-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3′。
1.3.4 RNA 提取 对采集的疑似感染PEDV病料加入5倍体积的生理盐水后进行组织匀浆并反复冻融3次，然后取上清按照说明书进行RNA提取。对于传代3次后且出现细胞病变的细胞，利用移液器将其悬浮后反复冻融3次，离心取上清后按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒说明书提取RNA。