TCF25��干扰慢病毒载体的构建与鉴定

　　摘 要 为构建一个针对TCF25（transcription factor 25）基因的慢病毒干扰载体， 设计并合成3组针对TCF25的短发夹RNA序列 （shRNA），通过基因重组技术连入 pLL3.7载体，酶切鉴定及DNA测序后，重组正确的pLL3.7质粒与病毒包装质粒共转染293FT细胞，培养48 h后，分别收集细胞培养上清液，感染H9C2细胞，Westernblot检测TCF25在H9C2细胞中的表达.结果显示TCF25蛋白在H9C2细胞中的表达被抑制.这说明TCF25的慢病毒干扰载体构建成功.
　　关键词 TCF25基因；293FT细胞；H9C2 细胞；慢病毒载体
　　中图分类号 Q786文献标识码 A文章编号 10002537（2016）02002306
　　Construction and Characterization of a Lentiviral Vector for RNA Interference of TCF25
　　LI Youfeng， PENG Hao， GAO Jianfang， GAO Jing， CHEN Yu， WU Xiushan， LI Yongqing*
　　（Center for Heart Department， Key lab of MOE for Department Biology and Protein Chemistry，
　　Hunan Normal University， Changsha 410005， China）
　　Abstract Objective To construct a lentiviral vector for RNA interference of TCF25 （transcription factor 25） gene and identify it. Methods Three pairs of complementary short hairpin RNA （shRNA） oligonucleotides targeting the TCF25 gene were designed， synthesized， and then inserted into pLL3.7 vectors by gene recombination technology. The recombinant plasmid was identified by enzyme digestion and DNA sequencing. Correct recombinant plasmids were cotransfected with packaging plasmids into 293FT cells. The cell culture supernatant was obtained after 48 hours， and then applied to infect H9C2 cells. The expression of TCF25 in H9C2 cells was detected by westernblot. Results The recombinant plasmid was successfully construct(转载自：www.BdfQy.Com 千 叶帆 文摘:TCF25��干扰慢病毒载体的构建与鉴定)ed. The westernblot showed that the expression of TCF25 in H9C2 cells was inhibited after the cells were successfully infected with the lentiviral vector supernatant. Conclusion The lentiviral vector interfering TCF25 was constructed successfully.
　　Key words TCF25 gene； 293FT cell； H9C2 cell； lentiviral vector
　　TCF25（transcription factor 25）是在小鼠胚胎发育过程中广泛表达的一个含有bHLH结构域的转录因子，且其C端还含有一个功能未知的DUF654结构域.根据TCF25广泛的表达模式和包含的转录激活结构域，推测其可能在脑和心脏等各种器官发育过程中发挥重要的调控作用[13].同时，已有研究表明TCF25作为SRF信号通路的抑制因子调控基因的表达，且能够抑制P19CL6细胞向心肌细胞分化[4]，但其具体作用机制需要继续探索.
　　RNA干扰（RNA interference，缩写RNAi）是指在进化过程中高度保守的双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的基因沉默现象，能够特异性剔除或关闭靶基因的表达[5].目前，该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域等[6].RNAi技术主要是将siRNA序列设计为一段shRNA（short hairpin RNA，短发夹RNA）克隆进质粒载体中，转染细胞后被转录形成一个双链RNA诱导基因沉默发生.慢病毒载体是根据HIV病毒基因特征，利用其基因结构重组构建而成.其能够将外源目的基因或外源的shRNA高效地整合到宿主基因组上并持久表达[78].慢病毒载体能够高效地感染心肌细胞、肿瘤细胞和内皮细胞等各类细胞系.同时，对于原代细胞和不分化细胞等较难转染的细胞，慢病毒载体也能够大大提高目的基因的转染效率和基因整合到宿主细胞基因组上的几率.基于其强大的转染能力，慢病毒载体已经被广泛应用于基础和临床医学研究[910].
　　为将TCF25的shRNA高效且稳定地导入各类细胞中，本实验拟构建针对TCF25的重组慢病毒载体，用于研究TCF25的功能机制.
　　1 材料与方法