摘要：2011年9月，泰州某猪场暴发疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征传染性疾病。采集发病猪腹股沟淋巴结、脾脏和肺脏组织，研磨成组织混悬液，经PCR检测、阳性产物测序，阳性病料悬液经0.22 μm滤膜过滤后接种PK15细胞，连续盲传5代后收取细胞病毒液并提取DNA，PCR检测及间接免疫荧光鉴定，结果表明，该分离株为猪圆环病毒2型（PCV2），命名为TAIZ110926株，目标序列提交给NCBI，获得了序列号：KF039888。
关键词：猪圆环病毒2型；分离；鉴定；目标序列
中图分类号： S858.285.3
文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）04-0294-02
猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是迄今为止发现的一种最小的动物病毒，具有猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2）2种基因型。PCV2感染猪群能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、猪皮炎和肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）及怀孕母猪繁殖障碍（sow abortion and mortality syndrome，SAMS）等[1]。血清学和病原学调查证实，PCV2呈世界性分布，给养猪业造成了巨大的经济损失[2-3]。本研究通过对泰州市某猪场疑似PMWS患猪采集肺脏及淋巴结等组织病料进行PCV2的分离、鉴定，以期为今后深入研究和科学防控该病提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征猪的腹股沟淋巴结、脾脏和肺脏等组织，于2011年9月26日采自泰州市某猪场。无PCV污染的PK15由江苏省动物流行病学研究中心保存。基因组DNA快速抽提试剂盒（动物）、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2及10×PCR buffer均为上海生工生物工程有限公司产品，100 bp DNA Ladder和6×DNA 凝胶载入染料（Loading Dye）购自Fermentas公司。猪源抗PCV2阳性血清，购自VMRD公司；羊抗猪IgG-FITC，购自SANTN CRUZ公司。胰酶细胞消化液，购自上海碧云天生物技术有限公司；新生牛血清和DMEM培养基购自上海生工生物工程有限公司。
1.2 引物的设计与合成
根据文献[4]的方法，合成1对PCV2引物，片段针对PCV2 ORF2基因中的一段序列，长487 bp。引物序列为上游引物：5′-CTgTTTTCgAACgCAgTgCC-3′；下游引物：5′-gCATCTTCAACACC(转自：wWw.bdFqy.com 千 叶帆 文摘:猪圆环病毒2型泰州株的分离鉴定)CgCCT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3 病料处理
将采集的脾脏、淋巴结和肺等病变组织，研磨研碎，按1 ∶5 加入无菌含双抗的PBS溶液，混匀，反复冻融3次，离心取上清，用孔径0.22 μm滤器过滤后，-20 ℃保存备用。
1.4 病料的PCR检测和测序
用基因组DNA快速抽提试剂盒，按说明书上的操作方法提取组织病料DNA。以提取的组织病料DNA为模板进行PCR扩增，PCR采用50 μL反应体系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 μmol/L上下游引物各1 μL，用灭菌超纯水补足50 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察电泳图谱，拍照记录结果。
PCR产物的回收和纯化：PCR产物电泳后，按Agrose Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa）说明书进行，回收纯化预期大小的靶片段。
PCR产物的克隆、鉴定、序列测定：取3.2 μL回收纯化产物与pGEM-T easy vector载体（Promega）4 ℃过夜连接。连接产物转化至DH5α感受态细胞，在IPTG+X-gal+Amp的LB平板上筛选白斑，常规方法小量提取质粒。质粒初步电泳验证后，进行PCR鉴定。选择阳性克隆，送南京Genscript公司在ABI 3720 DNA测序仪上测序：T7和SP6或M13+和M13-双向测序。
基因序列比对：采用Lasergene 7.1版（DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA）进行序列的拼接编辑；使用NCBI网站提供的BLAST程序，查找同源率最高的核苷酸序列以进行验证。
1.5 病毒的分离培养
将上述“1.3”节处理的经PCR检测呈PCV2阳性的病料悬液接种于长至半融合状态的PK15细胞上，37 ℃孵育1 h后，吸取病毒液，PBS洗涤2次，加入维持液于37 ℃、5%CO2培养箱中培养72 h，收集细胞反复冻融3次后，取上清继续在PK15细胞上盲传5代。
1.6 病毒的间接免疫荧光鉴定
将第5代分离株接种于长满单层的PK15细胞，37 ℃孵育1 h后，吸取病毒液，PBS洗涤2次，加入维持液于37 ℃、5%CO2培养箱中培养72 h；同时以未接种病毒的PK15细胞作为阴性对照。待检细胞使用PBS洗涤3次，冰甲醇室温固定30 min；PBS洗涤3次，加入PCV2一抗（猪PCV2阳性血清），37 ℃孵育1 h；PBS洗涤3次，再加入FITC标记的羊抗猪二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次后，置于Olympus倒置荧光显微镜下观察。