摘要 采用平板对峙法，从安徽水稻根际土壤样品中筛选对稻瘟病菌具有较强抑菌活性的拮抗细菌，通过菌落形态观察、生理生化特征、gyrB 基因序列分析对该菌株进行鉴定，测定抑菌谱，对其抑菌机制进行初步研究。结果表明，拮抗菌株WH1G对稻瘟病菌具有较强的抑制作用，抑制率达91.79%，经鉴定为解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。该菌可产生蛋白酶和纤维素酶，不产生几丁质酶和β1，3葡聚糖酶；用代谢产物无菌滤液处理稻瘟病菌，可造成孢子萌发率降低，菌丝扭曲异常、分支明显减少并产生大量泡囊。该菌对常见的20种植物病原真菌及细菌均具有不同程度的拮抗作用，表现出广谱抗菌活性。
关键词 稻瘟病菌； 解淀粉芽胞杆菌； 鉴定； 抑菌活性
中图分类号： S 476
文献标识码： A
稻瘟病是由稻瘟病菌（M(转自：wWw.bdFqy.com 千 叶帆 文摘:水稻稻瘟病拮抗细菌WH1G的筛选鉴定及其抑菌活性)agnaporthe oryzae）引起的一种真菌性病害，是世界性稻作病害，是影响水稻高产最严重的威胁之一，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失达11%～30%[12]，因此稻瘟病的防治成为水稻生产中的重要问题。
目前，稻瘟病的防治主要是采用栽培水稻抗瘟性品种和利用化学农药防治，但因抗病品种的单一化、化学农药的危害以及病原菌抗药性的产生，使水稻稻瘟病的防治受到一定的限制[34]。因此，生物防治越来越受到人们的关注。张芬等[5]从水稻根际土壤分离获得对稻瘟病具有高效抑菌活性的枯草芽胞杆菌T429（Bacillus subtilis T429）和伯克霍尔德菌属真菌T392（Burkholderia sp. T392）；刘诗胤等[6]分离获得对稻瘟菌具有一定防效的枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、短小芽胞杆菌（B.pumilus）和链霉菌（Streptomyces sp.）；温小红等[7]、周华强等[8]、Kuo等[9]、Tendulkas等[10]分别获得对稻瘟病有一定防效的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas）、多黏类芽胞杆菌（Paenibacillus polymyxa）、绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）。
解淀粉芽胞杆菌是一种与枯草芽胞杆菌亲缘性很高的细菌，在自然界中分布广泛，其生长过程中可以产生一系列具有广泛抑制真菌和细菌活性的代谢产物[11]， 因此，在生物防治方面具有广阔的应用前景，已逐步成为具有生物农药开发潜力的微生物。目前已有报道利用解淀粉芽胞杆菌防治水稻纹枯病、水稻细菌性条斑病、水稻恶苗病的研究[1215]，但是利用解淀粉芽胞杆菌防治水稻稻瘟病菌的研究国内外还未有报道。
本研究从水稻根际土壤中分离筛选出1株对水稻稻瘟病具有强烈抑制作用的拮抗菌株WH1G，通过形态观察、生理生化特征、gyrB 基因序列分析对该菌株进行了鉴定，测定了其抑菌谱，并进行了胞外酶活性检测，研究了其代谢产物对稻瘟病菌菌丝生长及孢子萌发的影响，对其抑菌机制进行初步研究，这将为开发、研制相应的生防菌剂奠定基础。
1 材料和方法
1.1 供试菌株
拮抗菌株WH1G为本研究小组从安徽省水稻根际土壤中分离筛选得到；供试水稻稻瘟病菌及用于抑菌谱测定的其他常见的植物病原真菌和细菌（表1，表2）均由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所分离和保藏。
1.2 培养基
拮抗细菌分离、培养及供试细菌培养所用培养基为改良的NA培养基（牛肉浸膏 1.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，蔗糖10.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8～7.0），病原真菌培养及拮抗谱测定采用PDA培养基，胞外酶活力测定采用选择性培养基[1618]。
1.3 拮抗细菌的分离、纯化及筛选
1.3.1 拮抗细菌的分离、纯化
在水稻生长季节，从安徽省水稻田采集水稻根际土壤，采用5点法采样，每点各收集土样200 g，装入无菌保鲜袋，记录编号，保存备用。
拮抗细菌分离采用平板稀释法[19]，称取土样10 g，放入100 mL无菌水中，摇床上振荡30 min，静置至澄清。用无菌枪头吸取上清液100 μL加入900 μL无菌水中，用无菌水依次稀释制备10-4、10-5、10-6、10-7和10-8土壤稀释液，各吸取稀释液100 μL 涂布于改良的NA分离培养基平板上，28℃恒温培养48 h，挑取形态、颜色等培养性状不同的细菌单菌落画线培养、纯化并保存。
1.3.2 拮抗细菌的筛选
采用平板对峙法[20]测定分离的细菌对水稻稻瘟病菌的抑制活性。取新鲜的稻瘟病菌5 mm菌饼接于PDA培养基平板中央，在距离中心3 cm处呈对角线放置3个直径5 mm的滤纸片，每个滤纸片接种2 μL的待测细菌菌悬液，设无拮抗细菌处理为对照，每处理重复3次，置于28℃恒温箱内培养，及时观察、记录抑菌现象，测量菌落直径，计算抑制率，抑制率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-原菌碟直径）×100。挑选抑菌圈直径大，抑制率高，且拮抗作用持久的菌株进行复筛。
将初筛的拮抗菌株分别接种于5 mL改良的NA液体培养基，置28℃摇床180 r/min培养36 h后，10 000 r/min离心10 min，取上清用0.45 μm细菌过滤器过滤，得到代谢产物的无菌滤液。将代谢产物与PDA培养基混合后倒平板，然后在平板中央接种5 mm稻瘟病菌菌碟，以不加代谢产物的PDA培养基为对照，28℃恒温箱内培养5 d，用十字交叉法测量病原菌菌落直径，计算菌丝生长抑制率。
1.4 拮抗细菌的抑菌谱测定