摘要：【目的】筛选出最适宜兴义维蚋蚋卵（胚胎）原代细胞的培养条件和最佳培养基组合，并对其原代细胞进行鉴定，为蚋类细胞系的建立打下基础。【方法】采用组织块和单细胞法对兴义维蚋蚋卵（胚胎）进行原代细胞培养，分析培养基、温度、pH、CO2和培养器皿对细胞培养的影响；并测定蚋卵（胚胎）及原代细胞的rDNA-ITS区序列，通过构建基于ITS区序列的蚋类系统发育进化树鉴定其种属来源。【结果】兴义维蚋蚋卵（胚胎）原代细胞最适宜的培养方法为组织块法，培养基为改良型Shields and Sang M3，pH 6.0～6.5，培养温度28 ℃，恒温生化培养箱和5% CO2培养箱对原代细胞培养无明显差异，培养器皿为经多聚赖氨酸（PLL）处理的一次性塑料培养皿/板。由基于ITS区序列构建的蚋类系统发育进化树可知，蚋卵（胚胎）及其原代培养细胞均来源于兴义维蚋。【结论】成功建立的兴义维蚋蚋卵（胚胎）原代细胞培养方法可在科研生产中进一步推广应用。
关键词： 兴义维蚋；蚋卵（胚胎）；原代细胞；培养；鉴定
中图分类号： S852.743 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）11-1945-07
Abstract：【Objective】The present study was conducted to select the most suitable culture conditions and optimal culture media for culturing primary cells of eggs（embryos） in Simulium（Wilhelmia） xingyiense， and identify the primary cells in order to lay a foundation for establishment of blackfly cell lines. 【Method】Primary cells of eggs（embryos） in S.（W.） xingyiense were cultured using tissue block method and single cell method. The influence factors for cell culture were analyzed， including medium， temperature， pH value， CO2 and culture vessels. At the same time， the sequences of rDNA-ITS region of eggs（embryos） and primary cells were determined， and blackfly phylogenetic tree was established based on their ITS sequences to identify their species origin. 【Result】The tissue block method was the optimal culture method for culturing the primary cells of eggs（embryos） in S.（W.） xingyiense. The appropriate culture medium was modified Shields and Sang M3 with pH 6.0-6.5 and 28 ℃ culture temperature. Constant temperature biochemical incubator and 5% CO2 incubator made no significant differences on culturing primary cells. Poly-L-lysine（PLL） treated plastic petri dishes/plates could be used as culture vessels. The result of blackfly phylogenetic tree based on ITS sequences showed that blackfly eggs（embryos） and their primary cells were derived from S.（W.） xingyiense. 【Conclusion】The culture method for primary cells of eggs（embryos） in S.（W.） xingyiense successfully established can be further applied in scientific research and production.
Key words： Simulium（Wilhelmia） xingyiense； blackfly egg（embryo）； primary cell； culture； identification
0 引言
【研究意义】昆虫细胞培养是细胞工程研究的基本技术之一，已成为现代实验生物学的重要研究手段（李守信等，2005）。昆虫细胞培养来源于不同组织，并广泛应用于医学、遗传学及生物学等研究领域（Smagghe et al.，2009），是研究昆虫生理生化、生物反应器及表达基因产物等的重要材料（Reid et al.，2016）。蚋类俗称黑蝇（Blackfly），隶属于昆虫纲（Insecta）双翅目（Diptera）蚋科（Simuliidae），是人类和畜禽多种疾病（盘尾丝虫病、禽鸟住白细胞虫病）的传播媒介，对家畜的危害尤为严重，轻者引发变态反应，造成肉、乳产量下降，重者可导致家畜死亡，影响社会公共卫生（陈汉彬等，2016）。因此，加强蚋类细胞培养体系研究，对了解蚋类生态习性及其生物防治具有重要意义。【前人研究进展】迄今为止，世界范围内已建成800多株昆虫细胞系，包括黑腹果蝇细胞系（BSR-9840）、白纹伊蚊细胞系（Aa-778）和嗜人按蚊细胞系（Ana-104）等，这些细胞系主要来源于双翅目和鳞翅目昆虫（张寰等，2007）。昆虫细胞系已广泛应用于病毒传播和疾病治疗等领域的基础与应用研究，如果蝇和白纹伊蚊细胞系已用于研究Sindbis病毒与细胞间的交互作用（Mudiganti et al.，2006；唐芬芬等，2015；Roest et al.，2016）；蜜蜂、蚊类昆虫细胞系主要用于研究我国蝙蝠科病毒、虾黄头病毒及登革热病毒的传播途径（Gangnonngiw et al.，2010；Xia et al.，2014；Yang et al.，2015）。此外，昆虫细胞系可用于研究信号转导通路或作为生物反应器生产疫苗（Mena and Kamen，2011；Shilo，2016），或用于筛选新型化学杀虫剂（Smagghe et al.，2009）及研究溴氰菊酯农药抗性基因（Chi et al.，2016）。【本研究切入点】目前，蚋类研究主要集中在形态和分子水平（杨明等，2004；徐旭等，2012；陈汉彬等，2016），尚无针对蚋类细胞培养的研究报道。【拟解决的关键问题】以贵州省贵阳市郊区兴义维蚋[Simul(本文来自：Www.bdfqY.cOm 千 叶帆文 摘:兴义维蚋蚋卵（胚胎）原代细胞培养及鉴定)ium（Wilhelmia） xingyiense]蚋卵（胚胎）为材料，筛选出最适宜兴义维蚋蚋卵（胚胎）原代细胞的培养条件和最佳培养基组合，并对其原代细胞进行鉴定，以期为蚋类细胞系的建立打下基础。