杀松材线虫海洋细菌HT��11的鉴定及培养条件研究

　　摘要[目的] 从海洋中分离并筛选具有杀松材线虫活性的细菌。[方法] 采用稀释涂布平板法对采自青岛近海海域的样品进行细菌分离，采用浸渍法测定菌株的杀线虫活性，并对筛选菌株的形态学、生理生化特性和16S rDNA序列进行测定，通过单因素试验筛选产生杀线虫活性物质的最适培养条件。[结果] 共分离到36株海洋细菌，根据杀线虫活性筛选出1株具有高杀线虫活性的细菌HT11。该菌株分离自牡蛎，其培养滤液处理松材线虫24 h的校正死亡率高达92.41%。根据形态学、生理生化特性和16S rDNA序列测定及其系统发育分析结果，将菌株HT11鉴定为考克氏菌属（Kocuria）。单因素试验结果表明，该菌株在营养肉汤（NB）培养基中产生杀线虫活性物质的最适培养条件为：海水浓度100%，初始pH 7.0，培养温度25 ℃，培养时间3 d。[结论] 该研究可为海洋微生物资源的开发及其杀松材线虫天然活性物质的利用提供理论依据。
　　关键词海洋细菌；杀线虫活性；松材线虫；鉴定；培养条件
　　中图分类号S767.3+2文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-024-05
　　Identification and Culture Conditions of Marine Bacterium HT11 with Nematicidal Activity against Bursaphelenchus xylophilus
　　CHEN Congcong，GUO Qunqun，WANG Chao，GUO Daosen* et al （College of Life Sciences，Qingdao University，Qingdao，Shandong 266071）
　　Abstract [Objective] To isolate and screen the marine bacteria with nematicidal activity against Bursaphelenchus xylophilus from the sea.[Method] The marine bacterial strains were isolated from the samples collected from the subtidal zones near Qingdao coast using the dilution and streak plate method； nematicidal activity of strains were detected by immersion method.The morphology，physiological and biochemical characters，and 16S rDNA sequence of the screened strai(转自：wWw.bdFqy.com 千 叶帆 文摘:杀松材线虫海洋细菌HT��11的鉴定及培养条件研究)ns were also detected.The optimal cultivation conditions to produce nematicidal activity substances were detected by single factor test.[Result] A total of 36 marine bacterial strains were isolated from the samples.One of these strains HT11 had high nematicidal activity，which was isolated from oyster.Its corrected mortality reached as high as 92.41% after treated with the culture filtrate for 24 h .According to the results of morphology，physiological and biochemical characters，16S rDNA sequence and phylogenetic analysis，strain HT11 was classified into the genus of Kocuria.Results of single factor experiment indicated that the optimal cultivation conditions of HT11 for the production of nematicidal substances were 100% seawater concentration，initial pH 7， 25 ℃ cultivation temperature，and 3 d cultivation time.[Conclusion] This research provides theoretical foundation for the development of marine microorganism resources and the utilization of natural nematicidal substances.
　　Key wordsMarine bacteria； Nematicidal activity； Bursaphelenchus xylophilus； Identification； Culture conditions
　　松树萎蔫病（Pine wilt disease，PWD）是松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）入侵松属植物后引起寄主萎蔫并快速枯死的一种毁灭性疾病[1]，传播媒介为松墨天牛（Monochamus alternatus）。该病在全球范围内造成了巨大的经济损失和生态环境的破坏，在东亚尤其是日本、中国、韩国[2]以及西欧的葡萄牙[3]和西班牙[4]损失较为严重。我国于1982年首次在江苏省南京市发现该病，截至2011年已扩散至全国14个省（市），且呈扩大趋势，随着国际贸易的往来，该病传播扩散的速度也在不断加快，因此松树萎蔫病已经引起许多国家的高度重视[5]。在控制该疾病方面，一般采用物理方法和化学方法，例如对患有松树萎蔫病的松树进行砍伐和用烟熏蒸来控制昆虫媒介[6]，向染病区域喷施噻虫啉等杀虫药剂[7]，对树干注射合成农药（阿维菌素或甲维盐）[7]或者在疫区周围减少松林的种植等，而这些方法中最有效的是化学农药防治方法。然而，化学农药具有高毒、高残留的特点，可对空气、水体和土壤环境造成污染，间接对人类造成危害[8]，因此化学药剂的应用正在逐步受到限制。目前，从自然界中寻找对松材线虫具有高致死性的微生物及其代谢产物已成为研发新型杀线虫剂的研究热点之一。这些微生物大多数是来自陆生环境的捕食性真菌、内寄生真菌、产毒真菌、杀线虫细菌和杀线虫放线菌等[9-10]。由于海洋存有高压、高盐、寡营养、低温等特殊生境，促使海洋微生物在进化过程中具备与陆地微生物不同的特殊代谢途径，从而可能会出现种类繁多、结构新颖、生物活性强的代谢产物。近年来，具有杀线虫活性的海洋微生物已有报道。郑海营等[10]从沙蟹体内分离出2株具有高杀松材线虫活性的巨大芽孢杆菌（Bacillius megaterium）。于洁等[11]从菲律宾蛤仔消化道内分离出1株产黑假交替单胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens），其培养滤液处理松材线虫24 h校正死亡率为82%。Yu等[12]研究了1株分离自海水的海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas marina）和1株分离自海湾扇贝的Vibrio atlanticus的杀线虫活性，发现这2株细菌培养液中的挥发性有机化合物对松材线虫有很强的杀灭作用。徐中强等[13]从青岛附近海域中分离到1株具有强杀线虫活性的轮枝孢属（Verticillium）真菌，该菌菌丝的破碎滤液处理松材线虫28 h校正杀死率为84.1%。李子等[14]从青岛附近海域分离的35株真菌中筛选到1株青霉属（Penicillium）菌株ML5，用其发酵液处理松材线虫72 h的校正死亡率为86.51%。笔者对分离自青岛近海海域样品中的海洋细菌进行了杀松材线虫活性菌株的筛选和鉴定，并对高杀线虫活性菌株产杀线活性物质的最佳培养条件也进行了探索，旨在为海洋微生物资源的开发和杀松材线虫天然活性产物的利用提供理论依据。