摘要
甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus， MNSV）及瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus， CCYV）近年来在瓜类种植区均大面积发生，危害较为严重，已成为制约甜瓜生产的重要因素。本研究广泛收集疑似感染MNSV及 CCYV的甜瓜病叶，从中提取植物总RNA进行RTPCR扩增，将产物分别连接到pEASYT1 Simple克隆载体上，对含有目的片段的重组子进行测序及比对分析。结果显示得到了与预期结果一致的DNA序列，其扩增产物大小分别为673 bp（MNSV）和877 bp（CCYV）。同源性分析结果表明，MNSV和CCYV寿光分离物的核苷酸序列与中国其他地区或一些国家已报道的分离物同源性达99%～100%。
关键词
甜瓜坏死斑点病毒；瓜类褪绿黄化病毒；RTPCR；序列分析
中图分类号：
S 436.5
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.023
Abstract
Melon necrotic spot virus （MNSV） and Cucurbit chlorotic yellows virus （CCYV） have seriously affected the yield and quality of melons in large melongrowing areas in recent years. In this study， diseased leaves infected by MNSV and CCYV were widely collected from Shouguang， Shandong Province. Total RNA were extracted from these leaf tissues and RTPCR was performed. The PCR products were inserted into pEASYT1 Simple cloning vector， and the expected DNA fragments with the size of 673 bp （MNSV） and 877 bp （CCYV） were sequenced and analyzed by BLAST search in GenBank， respectively. Homology analysis showed that nucleotide sequence of MNSV and CCYV isolates from Shouguang had 99%-100% identity with those isolates from other parts of China or some countries previously reported.
Key words
MNSV；CCYV；RTPCR；sequence analysis
甜瓜（Cucumis melo）是起源于非洲和亚洲热带地区的喜温植物，属葫芦科，是我国重要的经济作物和深受消费者喜爱的水果之一。甜瓜也是山东省寿光市种植面积较大的瓜果品种之一，常年种植达2×103 hm2，其中最有名的是‘玉锦’甜瓜，如今已销往全国各地。但是近年来，各种病虫害，尤其是病毒病对甜瓜危害较重，严重影响了甜瓜的产量和品质，其中，甜瓜坏死斑点病毒及瓜类褪绿黄化病毒在瓜类作物中大面积发生，严重危害了甜瓜等瓜类作物的生长[15]。
甜瓜坏死斑点病毒属于香石竹斑驳病毒属（Carmovirus），除侵染甜瓜外还能够侵染其他多种葫芦科植物，如黄瓜、西瓜、丝瓜、葫芦、南瓜等；其主要
以RTPCR为基础的分子检测技术已被广泛应用于检测侵染甜瓜以及其他葫芦科作物的病毒[810]。本研究采用RTPCR检测了两种典型症状的甜瓜病样，对于研究寿光以及山东地区甜瓜上病毒的基因结构、流行规律、综合防治对策和抗病育种均具有重要的意义。
1材料和方法
1.1材料
2013-2014年在山东省寿光市的甜瓜种植区，采集了具有典型MNSV和CCYV症状的甜瓜病叶各10份，保存于-80 ℃；两种病毒的阳性对照由山东农业大学植保学院的竺晓平教授提供。
植物RNA提取试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、2× Taq master mix、PCR产物回收试剂盒等购自北京科百奥生物科技有限公司；pEASYT1 Simple克隆试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2病叶总RNA的提取
分别称取采集的甜瓜病叶及健康叶片0.3～0.5 g，利用植物RNA提取试剂盒提取其总RNA。
用于检测MNSV的PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃下继续延伸10 min。
用于检测CCYV的PCR反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃下继续延伸10 min。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6PCR产物的回收及克隆
使用PCR产物回收试剂盒快速回收相应的目的片段，并将其分别与pEASYT1 Simple克隆载体连接，连接产物转入大肠杆菌Trans1T1 感受态细胞中，经菌液PCR鉴定的阳性菌落，送到北京华大基因科技有限公司测序。