摘 要：根据Genebank中orf224和orfl38基因序列的保守区设计特异引物，对2个甘蓝不育材料PM、QM的mtDNA进行PCR扩增。试验结果表明，orfl38特异引物对2个不育材料的mtDNA扩增出350 bp大小的清晰条带；不育材料的特异片段与萝卜Ogu CMS所具有的Ogu orfl38基因同源度达92.55%，长度均为297 bp，因此，初步推断2个不育材料是Ogura胞质雄性不育类型。
关键词：甘蓝；细胞质雄性不育：分子鉴定
中图分类号：S635.1
文献标识码：A
文章编号：1001-3547（2015）08-0008-04
结球甘蓝（Brassica oleracea L var. capitata L_），属十字花科芸薹属，为一种重要的蔬菜类作物。由于不结球白菜杂种优势非常明显，目前国内外主要推广的品种大多数为Fi代。不结球白菜杂种一代过去主要采用自交不亲和系繁殖，但繁殖成本较高，且亲本生活力易下降，制种时杂交率很难达到100%，容易出现假杂种；利用雄性不育系制种，不仅亲本繁殖容易、杂种一代纯度高，而且有利于新品种的自身保护。
细胞质雄性不育（CMS）是一种不能产生有活力花粉的母性遗传现象，是由线粒体基因组的重排引起的。CMS相关基因产生一种新的蛋白质，直接或间接破坏线粒体正常的生理功能，从而导致花粉败育，研究证明，高等植物CMS与其线粒体基因密切相关。目前比较常见的不育类型主要有波里马不育胞质（Pol CMS）、萝卜不育胞质（Ogu CMS）和甘蓝型油菜不育胞质（Nap CMS）等。芸薹属中波里马不育胞质、萝卜不育胞质研究较多，二者利用比较广泛。研究发现，几乎所有的细胞质雄性不育均与线粒体基因变异有关，其中起主要作用的是重要基因和未知片段重组形成的开放读码框（ORF）。人们在分子鉴定方面对不育类型进行了研究，可以有效区分CMS类型。张德双等利用orfl38引物证实了所获得的白菜CMS96胞质不育系mtDNA的特异序列与Ogu CMS有高度同源，为Ogu CMS不育类型。王春国等通过设计orfl 38特异引物对花椰菜细胞质雄性不育系和保持系进行了PCR扩增，证明所用细胞质不育材料为Ogu CMS不育类型。
本试验通过提取甘蓝细胞质雄性不育材料PM和QM mtDNA，设计orf138特异引物对其mtDNA进行PCR扩增，进而通过同源比对来鉴定PM和QM雄性不育的类型，证明2个雄性不育材料的分子类型，为今后研究甘蓝雄性不育的分子机制提供一定的帮助。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2个甘蓝细胞质不育品系PM和QM。
1.2 试验方法
①黄化苗的培育 首先取甘蓝种子1g左右，用清水冲洗干净，浸泡30 min，然后放置在无菌瓶中，于28℃暗培养7-10 d（定期更换补充烧杯内水源），长出的黄化幼苗即可作为试验材料。
②mtDNA提取试剂 DNase I、RNase A、蛋白酶K均为Takara产品，其余均为国产分析纯。a.匀浆缓冲液。0.4 mol/L甘露醇；50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5； 20 mmol/L EDTA -Na2； 1.0 mol/L NaCI； 0.2%BSA；0.1%半胱氨酸；1% PVP （BSA、半胱氨酸和PVP在试验前加）。
b.酶解缓冲液。0.4 mol/L甘露醇；50 mmol/L Tris-HCI，pH值7.5；10 mmol/L MgC12； 0.1% BSA（试验前加）。
c.Shelf缓冲液。0.5 mmol/L甘露醇；10 mmol/LTris-HCI， pH值7.5； 20 mmol/L EDTA-Na2。
d.裂解缓冲液。50 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0；20 mmol/L EDTA -Na2；(本文来自：WwW.BdfqY.Com 千叶帆文摘:甘蓝细胞质雄性不育材料的分子鉴定)5% SDS；O.1 mol/L NaCl；0.01%β-巯基乙醇。
e.EDTA溶液。0.5 mol/L，pH值8.0。
f.DNase I溶液。1 U/mL。
g.蛋白酶K溶液。20 mg/mL。
h.乙酸钠溶液。3 mol/L。
③线粒体提取a.称取20 9结球甘蓝黄化苗，在冰水中冲洗10 min后擦干，放入盛有100 mL匀浆缓冲液的烧杯中，置于4℃冰箱15-30 min（黑暗条件下）。
b.在匀浆机中高速匀浆，每次约15 s，重复5次。用8层纱布过滤匀浆液于预冷的50 mL离心管中，滤液于l000 r/min离心10 min。
c.取上清液2000 r/min离心10 min后，再取上清液于2000 r/min离心15 min，重复1次，弃上清液，得到粗线粒体沉淀。
d向每管沉淀中加入20 mL预冷的匀浆缓冲液，悬浮沉淀，于20000 r/min离心15 min，充分弃掉上清液，得粗线粒体沉淀。
e.在粗线粒体沉淀中加入1 mL预冷的酶解缓冲液，悬浮沉淀于2个离心管中，后每管加入5 mL酶解缓冲液，15 mL DNase I，混匀后室温放置，每5 min轻轻摇动悬浮液1次，30 min后放入冰浴中1 h。之后每管加入600 μL EDTA溶液，混匀后室温静止10 min终止DNase I消化反应。
f.将上述溶液小心铺于Shelf缓冲液上（每管25 mL），于18000 r/min离心20 min后收集沉淀。再用6 mL酶解缓冲液重新悬浮线粒体沉淀，并将悬浮液缓慢铺于Shelf缓冲液上（每管15 mL），于18000 r/min离心20 min，所得沉淀即为纯化的线粒体。
④mtDNA提取方法 a.向每管沉淀中加入6 mL酶解缓冲液，轻轻混匀后，分装到6个2 mL离心管中，于18000 r/min离心15 min后弃上清液。