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1株大分子有机物降解菌的分离、鉴定及酶学分析

日期:2018-07-19 10:42:16 浏览次数:

  摘要:通过平板培养法从高温堆肥中分离筛选出1株高温高效大分子有机物降解菌W-10。W-10具有同时分解纤维素、蛋白质和淀粉等大分子有机物的能力。该菌株的生长特性表明,在pH值为5.0、温度为50 ℃时,羧甲基纤维素酶(CMCase)、蛋白酶、α-淀粉酶的酶活性达到最高值,分别为144.75、97.51、83.85 U/mL。将测得的16S rDNA基因序列在NCBI数据库中进行同源性比对,综合形态特征和16S rDNA基因序列同源性分析,将该菌株初步鉴定为芽孢杆菌属。
  关键词:高温堆肥;大分子有机物;芽孢杆菌属;W-10
  中图分类号: X172文献标志码: A
  文章编号:1002-1302(2017)05-0268-03
  我国是农业大国,年产各类秸秆约8.0亿t,占世界秸秆总量的1/5左右。这些秸秆除了一部分用于饲料、造纸、纺织和燃料加工外,其余均作为农业废弃物丢弃或就地焚烧,不仅浪费了宝贵的资源,同时也污染了生存环境[1-2]。
  通过高温堆肥降解农业废弃物是资源化利用的良好途径之一。高温堆肥是一种利用各种微生物高温高效降解有机废弃物,并产生稳定的最终产物的过程。高温堆肥可有效促进纤维素废弃物的资源化利用,并降低农业废弃物对环境的污染。在堆肥发酵过程中,为缩短发酵周期及提高堆肥质量,以人为方式添加一些高温微生物,高温微生物产生的热稳定酶可将基质中的纤维素及木质素分解,并产生大量的能量和热量,不仅可以将农业废弃物转化为有机肥,而且可以有效抑制堆肥中有害病原菌的孶生。在堆肥基质中,除了纤维素外,还有其他蛋白质及糖类的存在,应深入研究并充分利用高温微生物对纤维素、蛋白质及糖类等大分子有机物的降解作用,加速农业废弃物转化为有机肥。因此,开展堆肥高温微生物的研究具有重要的意义[3-5]。
  [JP2]本研究从堆肥中筛选出能够高效降解纤维素、蛋白质和淀粉的高温菌株,并对其酶活性进行测定,目的在于为高效降解大分子有机物菌株的选育和相关酶制剂开发提供菌种资源。[JP]
  1材料与方法
  1.1试验材料
  1.1.1样品采集
  猪粪、城市生活垃圾及秸秆自然堆肥,堆体温度上升到55 ℃时,采集中层样品于无菌器皿中,4 ℃保存备用。
  1.1.2培养基
  (1)分离初筛培养基:牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏5.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,NaCl 5.0 g/L,水1.0 L,pH值为7.2~7.4。
  (2)大分子有机物降解复筛培养基.
  羟甲基纤维素钠培养基(CMC-Na培养基):CMC-Na 15 g/L、(NH4)2SO4 2.0 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 01 g/L、NaCl 6.0 g/L、CaCl2 0.1 g/L,固体培养基加1.5%琼脂,加蒸馏水补至1 L、pH值为7.0~7.5,压力为 1.05 kg/cm2、灭菌25 min。
  (3)刚果红纤维素鉴定培养基。(NH4)2SO4 0.2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、NaCl 0.05%、CMC-Na 2%、刚果红0.02%、琼脂2%、pH值自然。
  1.1.3主要仪器试剂

1株大分子有机物降解菌的分离、鉴定及酶学分析

  DNA Marker[宝生物工程(大连)有限公司];Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司];Taq聚合酶[宝生物工程(大连)有限公司];PCR仪(Mastercyclerpro)(Eppendorf公司);Gel Doc XR凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。
  1.2试验方法
  1.2.1菌种筛选
  (1)菌种的分离与初筛。
  [JP2]采取样品经剪碎、研细后,称取1 g放入装有99 mL无菌生理盐水的三角瓶中,180 r/min振荡30 min,静置;用移液管吸取1 mL上清液于含有9 mL无菌生理盐水的试管中,振荡均匀后,梯度稀释到10-3~10-7,吸取0.3 mL后3个稀释度的试样涂布于羟甲基纤维素钠平板培养基上,在50 ℃条件下可生长的菌落即具有纤维素分解酶能力,再从中挑选出菌落进行进一步划线分离。[JP]
  (2)菌种的复筛。将具有纤维素分解酶能力的菌株涂布于刚果红初筛培养基上,经72 h培养,分别测定水解圈直径(D)和菌落直径(d),并计算D/d值(即HC值)。挑取生长速度快且HC值大的菌株,再将HC值大的菌株接种于液体发酵培养基中,30 ℃、120 r/min 振荡培养72 h,3 000 r/min离心10 min,收集上清液即粗酶液,测CMC酶活性,选出CMC酶活性高产菌株,作为复筛菌株。
  1.2.2酶活的测定方法
  羧甲基纤维素酶(CMC酶,简称CMCase)活性的测定:
  参照文献[6]略作改进,1 mL 用 0.1 mol/L pH值为4.8的柠檬酸缓冲液配制的质量分数为1%的CMC-Na溶液,加入0.5 mL适当稀释的酶液,于50 ℃反应30 min后,加入1.5 mL二硝基水杨酸(DNS)试剂终止反应,沸水浴中煮沸5 min,稀释定容至25 mL,在530 nm下测定吸光度,按DNS法测定糖浓度。1个酶活性单位(IU)定义为1 min催化底物水解生成1 μg葡萄糖所需的酶量。以100 ℃水浴中灭活10 min的粗酶液为空白对照。
  微晶纤维素酶活性测定:
  吸取1.0 mL 10 g/L微晶纤维素悬浮液(称取1.000 g微晶纤维素,加0.05 mol/L pH值为48柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解,稀释定容至100 mL)和0.5 mL适当稀释的酶液,50 ℃保温1 h,离心后,取1.0 mL上清液用DNS法测还原糖生成量[7]。

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